Post by alamin4470 on Aug 13, 2023 5:40:22 GMT -5
PCR 扩增 GGTA1 区域8。引物 CMAH-S1 (5' CCAACCCTGTCATTCCAG 3') 和 GGTA1-F 引物 (5' CTAGAAATCCCCAGAGGTTAC 3') 分别用于对 ZFN 靶向的 CMAH 区域和 GGTA1 区域进行测序。 RBC 和 PBMC 的流式细胞术表型分析 红细胞 (RBC) 从四个来源获得：(i) 将双 KO 胎儿肝脏在 RPMI1640 中于 37°C 孵育 24 小的细胞；(ii) 6个月大的野生型猪；(iii) 胎儿GGTA1-KO第二
代猪；(iv) 成人捐献者。使用 Ficoll–Paque Plus 电话号码列表表从酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 中收集的全血制备猪和人外周血单核细胞 (PBMC)。 细胞用同凝素Griffonia simplicifolia IB4染色（IB4 凝集素) Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 和抗 Neu5Gc 抗体 (Sialix, Vista, CA, USA) 分别评估 Gal 和 Neu5Gc 的表达。还使用了用于与抗-Neu5Gc抗体比较的阴性对照抗体(Sialix)。将细胞与 IB4 凝集素在 4°C 下孵育 20 分钟。用稀释在HBSS中的封
剂(Sialix)洗涤细胞。然后将细胞用抗 Neu5Gc 抗体在 4°C 染色 1 小时，然后用驴抗鸡 DyLight 649（JacksonImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA）在 4°C 染色 40 分钟。在二抗之前和之后用稀释在PBS中的Sialix封闭剂洗涤用抗Neu5Gc抗体染色的细胞。使用 Accuri C6 流式细胞仪和 CFlow 软件（Accuri，安娜堡，密歇根州，美国）进行分析。 共焦激光扫描